本发明主要涉及制备、储存、运送和使用通过器官型培养制得的皮肤等同物的体系和方法。具体而言,本发明涉及在降低的温度(优选低于环境温度2-8摄氏度)下制备、运输、储存和使用通过器官型培养制得的皮肤等同物的体系和方法。所述方法包括无菌包装移植物,使得维持所述包装的无菌度和完整性直至用于移植目的之时。
1.一种用作伤口敷料的器官型培养的皮肤等同物的保存方法,所述方法包括:提供所述器官型培养的皮肤等同物和包装;处理所述皮肤等同物以致使该皮肤等同物中的细胞非活;和包装所述皮肤等同物以提供包装的皮肤等同物。
2.权利要求1的方法,其中所述处理步骤包括辐照所述皮肤等同物以致使所述皮肤等同物无菌和非活。
3.权利要求2的方法,其中所述辐照用γ辐照进行。
4.权利要求1的方法,其中所述处理步骤包括在使得所述皮肤等同物中的细胞非活的条件下干燥所述皮肤等同物。
5.权利要求4的方法,其中所述干燥通过选自真空干燥和冷冻干燥的方法来进行。
6.权利要求1的方法,其中所述处理在包装之前进行。
7.权利要求1的方法,其中所述处理在包装之后进行。
8.权利要求1的方法,其中所述处理包括在使得组成所述皮肤等同物的细胞非活的条件下干燥所述皮肤等同物,以及在使得所述皮肤等同物无菌的条件下辐照所述皮肤等同物。
9.权利要求8的方法,其中所述干燥步骤在所述包装之前进行,所述辐照步骤在所述包装步骤之后进行。
10.权利要求1的方法,其中所述器官型培养的皮肤等同物包含NIKS细胞。
11.权利要求10的方法,其中所述NIKS细胞包含编码抗微生物多肽的外源核酸序列。
12.权利要求11的方法,其中所述抗微生物多肽选自人β-防卫素1、人β-防卫素2、人β-防卫素3和组织蛋白酶抑制素。
13.权利要求11的方法,其中以10-500ng抗微生物多肽/毫升表面提取液的量,提供所述抗微生物多肽。
14.权利要求4的方法,其中将所述皮肤等同物干燥至最终质量小于湿皮肤等同物的50%。
15.权利要求4的方法,其中所述皮肤等同物再水化之后具有的初始DPM值为20-300,DPM变化值为5-400。
16.权利要求4的组合物,其中所述皮肤等同物再水化之后具有的抗张强度为0.1-5.0MPa。
17.权利要求1的方法,其中所述包装可热密封。
18.一种通过权利要求1的方法制备的包装人皮肤等同物。
19.一种通过权利要求8的方法制备的经包装的无菌人皮肤等同物。
20.一种组合物,所述组合物包含经分离的非活的体外人皮肤等同物。
21.权利要求20的组合物,其中所述皮肤等同物为无菌的。
22.权利要求21的组合物,其中所述无菌皮肤等同物为经辐照的。
23.权利要求20的组合物,其中所述皮肤等同物为经干燥的。
24.权利要求20的组合物,其中皮肤等同物具有的质量小于湿皮肤等同物质量的50%。
25.权利要求20的组合物,其中所述皮肤等同物包含NIKS细胞。
26.权利要求25的组合物,其中所述NIKS细胞包含编码外源多肽的外源核酸序列。
27.权利要求26的组合物,其中所述外源多肽为抗微生物多肽。
28.权利要求27的组合物,其中所述抗微生物多肽选自人β-防卫素1、人β-防卫素2、人β-防卫素3、组织蛋白酶抑制素及其组合。
29.权利要求28的组合物,其中以10-500ng抗微生物多肽/毫升表面提取液的量,提供所述抗微生物多肽。
30.权利要求24的组合物,其中所述皮肤等同物再水化后具有的初始DPM值为20-300,DPM变化值为5-400。
31.权利要求24的组合物,其中所述皮肤等同物再水化后具有的抗张强度为0.1-5.0MPa。
32.权利要求20的组合物,其中所述组合物为经包装的。
33.一种用于治疗伤口的方法,所述方法包括:提供权利要求20的组合物;和在使得所述皮肤等同物接触所述伤口的条件下施用所述皮肤等同物至伤口。
34.权利要求33的方法,其中将所述皮肤等同物暂时施用至所述伤口。
35.一种试剂盒,所述试剂盒包含含有权利要求20的皮肤等同物的包装。
36.权利要求35的试剂盒,其中所述皮肤等同物具有的保存期限为约一个月至约六个月。
37.一种组合物,所述组合物包含非活的、经分离的、体外器官型培养的皮肤等同物,该皮肤等同物具有的质量小于湿皮肤等同物质量的50%。
38.权利要求37的组合物,其中所述皮肤等同物包含至少一种由整合至所述皮肤等同物的细胞表达的外源抗微生物多肽。
39.权利要求20所述的组合物在治疗受试者中的用途。
40.权利要求20所述的组合物在治疗受试者的伤口中的用途。相关申请的交叉引用本申请要求保护提交于2008年11月4日的美国临时申请61/111,153的权益,所述申请案的内容通过引用以其整体结合于本文中。发明领域本发明主要涉及用于在冷藏或环境温度下长期储存通过器官型培养制得的皮肤等同物的体系和方法。背景发明新兴的组织工程学(TE)领域已准备好在即将到来的十年在器官疾病和功能障碍的治疗上取得巨大的进步。2001年,23种基于细胞的治疗获批在美国(U.S.)和欧洲上市,其中9种为皮肤替代物或移植物,且100多种产品正在开发中。(Dexa0Bree,Genomics-basedxa0Drugxa0Dataxa0Reportxa0andxa0Regenerativexa0Therapy(基于基因组学的药物数据报告和再生疗法)(1)2:77-96(2001))。2007年,将近100家公司参与了开发工程组织、基于细胞的治疗或相关的技术(Appliedxa0Dataxa0Research,2007年2月)。总体而言,该产业从1995年到2001年具有16%的年增长率。“结构”产业部分(例如,皮肤、骨、软骨)从1998年到2001年显示了85%的增长。2004年,组织工程皮肤置换物/替代物和活性伤口修复调节剂的美国市场估价近于1.95亿美元。预期销售额以9.5%的复合年增长率增加,在2014年达到近于4.81亿美元(MedTechxa0Insight,Windhoverxa0Information,2005年9月)。高级伤口护理技术的整个美国市场在2005年价值超过23亿美元。预计这在五年时期内以12.3%的平均年增长率增长,在2011年达到46亿美元(BCCxa0Research,PHM011E,2007年1月)。全球伤口护理市场在2006年估价为72亿美元,且包括传统和高级两个部分(Espicomxa0Businessxa0Intelligence,2007)。传统伤口护理产品主要由低技术的基于纱布的敷料组成,例如编织和非编织海绵、伸缩绷带(conformingxa0bandages)和不粘连绷带。高级伤口护理部分(全球41亿美元)为增长最快的区域,以每年10%的两位数增长(Espicomxa0Businessxa0Intelligence,2007)。虽然工程组织和工程器官的大量革命性和经济上重要的应用存在于人类健康的竞技场,但是该产业的全部经济潜力远未实现。目前,尽管对这些技术的全球投资超过35亿美元,但是全世界的上市组织工程公司中只有一家显示盈利。(Lysaghtxa0andxa0Reyes,Tissuexa0Engineering(组织工程学)7(5):485-93(2001))。工程组织被执业医师、医疗保健供应商和第二方支付者接受的主要障碍在于缺乏有效且高效地保藏和储存工程组织的方法。活细胞和组织产品的性质使得对其进行长期储存不切实际。当前的工程组织必须常常在小心控制的条件下储存和运送以维持生存力和功能。通常,工程组织产品花费数周或数月来生产但必须在制备后数小时或数天内使用。结果,TE公司必须不断地以最高生产力运转其生产设备并承担必须废弃的未售出产品的成本。这些存货损失,加之先前昂贵的制备过程,迫使价格至不切实际的水平。作为一个具体实例,APLIGRAF需要大约四周来制备,只在十天内可用且必须在使用前维持在20-23°C之间。作为另一个实例,EPICEL在便携式保温箱中由护理员从Genzymexa0Biosurgery的生产设备(Cambridge,MA)运输至使用点且在到达时立即使用。这些约束代表对开发方便且有成本效益的产品的重大挑战。虽然已开发冷冻保存作为储存问题的解决方法,但是已知其通过结冰、冷伤和渗透不平衡引起组织损伤。除了APLIGRAF,唯一获批的其他活皮肤等同物ORCEL,当前正作为一种冷冻产品在临床试验中,但弊端在于使用前必须维持温度低于-100°C。这要求专业的产品递送和储存条件,包括在运输期间使用危险物品,以及使用昂贵、危险且在乡村诊所和战地医院中不易获得的液氮来储存。此外,递送冷冻产品需要对终端用户部分进行专业培训以在使用前成功解冻组织。因此,本领域需要的是制备用于在使用点常规可获得的条件下储存的工程组织和细胞的改进方法。由于所有临床设备均已冷藏,开发可长期储存于标准冰箱中的皮肤等同物将大大改进这些产品的可用性和临床效用。开发可长期储存于环境温度下的皮肤等同物将进一步增加这类产品在战场上或各种第一响应情形中立即使用的可用性。发明概述本发明主要涉及用于在冷藏或环境温度下长期储存通过器官型培养制得的皮肤等同物的体系和方法。在一些实施方案中,本发明提供用作伤口敷料的器官型培养的皮肤等同物的保藏方法,所述方法包括:提供所述器官型培养的皮肤等同物和包装;处理所述皮肤等同物以致使皮肤等同物中的细胞非活;和包装所述皮肤等同物以提供经包装的皮肤等同物。本发明不限于处理所述皮肤等同物以致使组成所述皮肤等同物的细胞非活的任何具体方法来。在一些实施方案中,所述处理步骤包括辐照所述经包装的皮肤等同物以致使所述皮肤等同物无菌和非活。在一些实施方案中,所述辐照用γ辐照进行。在一些实施方案中,所述处理步骤包括在以下条件下干燥所述皮肤等同物,所述条件使得所述皮肤等同物中的细胞非活。本发明不限于任何具体的干燥方法。在一些实施方案中,所述干燥通过选自真空干燥和冷冻干燥的方法来进行。除非另有说明,本发明不限于任何具体的步骤顺序。在一些实施方案中,所述处理在包装之前进行。在一些实施方案中,所述处理在包装之后进行。在一些实施方案中,所述处理包括在使得组成所述皮肤等同物的细胞非活的条件下干燥所述皮肤等同物,以及在使得所述皮肤等同物无菌的条件下辐照所述皮肤等同物。在一些实施方案中,所述干燥步骤在所述包装之前进行而所述辐照步骤在所述包装步骤之后进行。本发明不限于使用任何具体的皮肤等同物。在一些实施方案中,所述器官型培养的皮肤等同物包含NIKS细胞。在一些实施方案中,所述NIKS细胞包含编码外源多肽的外源核酸序列。在一些实施方案中,组成此皮肤等同物的细胞表达多于一种外源多肽。本发明不限于使用任何具体的外源多肽。在一些实施方案中,所述外源多肽为抗微生物多肽。在一些实施方案中,所述抗微生物多肽选自人β-防卫素1、人β-防卫素2、人β-防卫素3和组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)。在一些实施方案中,由所述皮肤等同物提供的抗微生物多肽的量为1-1000ng抗微生物多肽/毫升表面提取液,在一些优选的实施方案中,由所述皮肤等同物提供的抗微生物多肽的量为1-1000ng抗微生物多肽/毫升表面提取液。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物干燥至最终质量小于湿的或未干燥皮肤等同物质量的75%、50%、25%或优选15%。在一些实施方案中,所述皮肤等同物再水化后,具有的初始DPM值为约20DPM-约300DPM,优选约70DPM-约140DPM,以及DPM变化值为约5DPM-约400DPM,优选约10DPM-约220DPM。在一些实施方案中,所述皮肤等同物再水化后,具有的抗张强度为约0.1-约5.0MPa,优选约0.4-约1.8MPa。在一些实施方案中,所述包装可热密封。在一些实施方案中,本发明提供通过前述方法制备的包装人皮肤等同物。在一些实施方案中,本发明提供通过前述方法制备的包装无菌人皮肤等同物。在一些实施方案中,本发明提供组合物,所述组合物包含分离的、非活的、体外人皮肤等同物。在一些实施方案中,所述皮肤等同物为包装的。在一些实施方案中,所述皮肤等同物为无菌的。在一些实施方案中,所述无菌皮肤等同物为经辐照的。在一些实施方案中,所述皮肤等同物为经干燥的。在一些实施方案中,所述皮肤等同物具有的质量小于湿皮肤等同物质量的50%。在一些实施方案中,所述皮肤等同物包含NIKS细胞。一些实施方案中,所述NIKS细胞包含编码外源多肽的外源核酸序列。一些实施方案中,组成所述皮肤等同物的细胞表达多于一种外源多肽。本发明不限于使用任何具体的外源多肽。在一些实施方案中,所述外源多肽为抗微生物多肽。在一些实施方案中,所述抗微生物多肽选自人β-防卫素1、人β-防卫素2、人β-防卫素3和组织蛋白酶抑制素。在一些实施方案中,由所述皮肤等同物提供的抗微生物多肽的量为1-1000ng抗微生物多肽/毫升表面提取液,在一些优选的实施方案中,由所述皮肤等同物提供的抗微生物多肽的量为1-1000ng抗微生物多肽/毫升表面提取液。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物干燥至最终质量小于湿的或未干燥皮肤等同物质量的75%、50%、25%或优选15%。在一些实施方案中,所述皮肤等同物再水化后,具有的初始DPM值为约20DPM-约300DPM,优选约70DPM-约140DPM,以及DPM变化值为约5DPM-约400DPM,优选约10DPM-约220DPM。在一些实施方案中,所述皮肤等同物再水化后,具有的抗张强度为约0.1-约5.0MPa,优选约0.4-约1.8MPa。在一些实施方案中,本发明提供治疗受试者的方法,所述方法包括提供如上述的皮肤等同物组合物,和将所述皮肤等同物在以下条件下施用至伤口,所述条件使得所述皮肤等同物接触所述伤口。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物暂时施用至所述伤口。在一些实施方案中,本发明提供试剂盒,所述试剂盒包含含有上述皮肤等同物组合物的包装。在一些实施方案中,所述皮肤等同物具有的保存期限为约一个月至约六个月。在一些实施方案中,本发明提供组合物,所述组合物包含非活的、分离的、体外器官型培养的皮肤等同物,该皮肤等同物具有的质量小于湿皮肤等同物质量的50%。在一些实施方案中,所述组合物包含至少一种由组成所述皮肤等同物所需的细胞表达的外源抗微生物多肽。在一些实施方案中,本发明提供前述组合物在治疗受试者中的用途。在一些实施方案中,本发明提供前述组合物在治疗受试者的伤口中的用途。附图描述图1辐照后组织的生存力。9F1和2D2组织为已辐照的,且在辐照后3、7或14天获取打孔活检以及使用MTT测定法分析生存力。数据表示测量自每个试验组中至少三个独立活检样品的平均值+/-标准偏差。图2角质形成细胞生存力/迁移测定。(A)表现出无角质形成细胞生长晕的外植体记为活角质形成细胞阴性。(B)角质形成细胞已迁移环绕在真皮边缘的样品记为活角质形成细胞阳性。图3成纤维细胞生长晕测定。用胶原酶处理来自对照和辐照9F1组织的活检,并将分离的细胞培养六天之后,用1%亚甲蓝染色以显现细胞集落。图4释放自辐照2D2和9F1组织的蛋白。在剂量0、1或5kGy下辐照人皮肤替代物组织。用水从在辐照后3天获取的打孔活检中提取蛋白且通过BCA测定法定量。数据表示来自四次测量值的平均值+/-标准偏差。图5辐照2D2组织的抗微生物活性。将获自未辐照和辐照2D2组织的打孔活检在无血清培养基中孵育所示时间。提取自这些组织的物质的抗微生物活性通过CFU计数来确定并针对对照细菌培养物进行归一化。每个数据点表示获自两个独立样品的平均值。图6辐照9F1组织的抗微生物活性。将获自未辐照和辐照9F1组织的打孔活检在无血清培养基中孵育4小时。来自这些组织的抗微生物活性通过CFU计数来确定并针对对照细菌培养物(设定其值为1)进行归一化。每个数据点表示来自指示处理组中组织的四个活检样品的平均值+/-标准偏差。图7辐照2D2组织的抗微生物活性。将获自未辐照和辐照2D2组织的打孔活检在无血清培养基中孵育4小时。来自这些组织的抗微生物活性通过CFU计数来确定并针对对照细菌培养物(设定其值为1)进行归一化。每个数据点表示来自指示处理组中组织的四个活检样品的平均值+/-标准偏差。图8从储存在营养凝胶或不粘连纱布上的皮肤等同物组织中释放的总蛋白。辐照人皮肤等同物组织且在14天后获取打孔活检并在0.2ml无菌水中于37°C孵育24小时。提取的蛋白通过BCA测定法来定量。数据表示来自四次测量值的平均值+/-标准偏差。图9冷冻干燥经辐照的工程皮肤等同物的组织学分析。将新鲜皮肤等同物与冷冻干燥的或冷冻干燥且经1kGy、5kGy或25kGy剂量水平辐照的皮肤等同物相比较。将组织切片用苏木精/伊红染色并在400x放大率下拍照。比例尺=200μm图10真空干燥经辐照的工程皮肤等同物的组织学分析。将新鲜皮肤等同物与真空干燥的或真空干燥且经1kGy、5kGy或25kGy剂量水平辐照的皮肤等同物相比较。将组织切片用苏木精/伊红染色并在400x放大率下拍照。比例尺=200μm图11经辐照的真空干燥和冷冻干燥皮肤等同物的生存力。条颜色表示(从左到右):黑色=0kGy(未辐照的);深灰色=1kGy;浅灰色=5kGy;白色=25kGy。数据点表示平均值+/-标准偏差(n=4-8),归一至新鲜制备的、未辐照皮肤等同物组织。图12干燥的经辐照皮肤等同物的表皮屏障功能。左面板:在10秒间隔内测量经1kGy、5kGy或25kGy辐照的冷冻干燥或真空干燥的工程皮肤组织在组织表面电容方面的变化。值表示来自两个独立组织各自的两个测量值的平均值+/-标准偏差。右面板:报道了经1kGy、5kGy或25kGy辐照的冷冻干燥或真空干燥组织的初始DPM值。条颜色表示(从左到右):黑色=0kGy(未辐照的);深灰色=1kGy;浅灰色=5kGy;白色=25kGy。值表示来自两个独立组织各自的两个测量值的平均值+/-标准偏差。图13干燥和辐照的工程皮肤组织的机械性能。条颜色表示(从左到右):黑色=0kGy(未辐照的);深灰色=1kGy;浅灰色=5kGy;白色=25kGy。数据为平均值±标准偏差。n=2-4定义本文所用的术语“皮肤等同物”、“人皮肤等同物”、“人皮肤替代物”和“器官型培养物”可替换地用于指角质形成细胞的体外衍生培养物,其已分层为鳞状上皮细胞。通常,所述皮肤等同物通过器官型培养制备且包含除了角质形成细胞层之外的真皮层。本文所用的术语“湿皮肤等同物”是指在器官型培养中或立即从器官型培养中移出的皮肤等同物。本文所用的术语“非活的”是指通过诸如MTT测定法等测定法确定为非活的细胞。本文所用的术语“无菌的”是指基本或完全无微生物或真菌污染的皮肤等同物。本文所用的术语“干燥的”是指已移除水分的组合物。“干燥皮肤等同物”为已移除水分的皮肤等同物,因此干燥皮肤等同物比湿的或立即从器官型培养中移出的皮肤等同物具有更低的水分含量。比较干燥皮肤等同物与湿皮肤等同物的质量以用作干燥程度的衡量,并反映干燥过程期间从所述皮肤等同物中移除的水量。本文所用的术语“NIKS细胞”是指具有保藏为细胞系ATCCCRL-1219的细胞特性的细胞。术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即,相同)。部分互补序列至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸的杂交,并使用功能术语“基本同源”提及。术语“结合抑制”,当用于指核酸结合时,是指由同源序列的竞争引起对结合靶序列的结合抑制。完全互补序列与靶序列的杂交抑制可在低严格性条件下使用杂交测定(DNA或RNA印迹、溶液杂交等)来检验。基本同源序列或探针在低严格性条件下竞争和抑制完全同源物与靶结合(即,杂交)。这并不是说低严格性条件允许非特异性结合;低严格性条件要求两个序列的相互结合为特异性(即,选择性)相互作用。不存在非特异性结合可通过使用第二个靶来检测,所述第二个靶缺乏甚至部分程度的互补性(例如,小于约30%的同一性);在非特异性结合不存在下,所述探针将不与所述第二个非互补性靶杂交。术语“基因”是指核酸(例如,DNA)序列,其包含产生多肽或前体(例如,KGF-2)所需的编码序列。所述多肽可由全长编码序列或由该编码序列的任何部分来编码,只要保留了全长或片段的所需活性或功能性质(例如,酶活性、配体结合、信号转导,等等)即可。该术语还包括结构基因的编码区和内含序列,该内含序列在5’和3’两个末端毗邻编码区,在任一末端的距离约1kb,使得所述基因对应全长mRNA的长度。位于编码区5’且存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区3’或下游且存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组两种形式。基因的基因组形式或克隆含有由叫做“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断的编码区。内含子为转录成核RNA(hnRNA)的基因区段;内含子可含有诸如增强子等调控元件。内含子被从核转录物或初级转录物中移除或“剪接掉”;因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)转录物中。翻译期间mRNA功能为指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。本文所用的术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”和“DNA编码”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核苷酸的顺序决定沿着多肽(蛋白)链的氨基酸的顺序。因此DNA序列编码氨基酸序列。本文所用的术语“重组DNA分子”是指由DNA区段组成的DNA分子,该DNA区段借助分子生物学技术连接在一起。本文所用的术语“纯化的”或“纯化”是指从样品中移除污染物。本文所用的术语“载体”用于指将DNA区段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。术语“运载体”有时与“载体”可替换使用。本文所用的术语“表达载体”是指以下重组DNA分子,其含有所需编码序列和对在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所需的适当核酸序列。原核生物中表达所需的核酸序列通常包括启动子、操纵基因(任选的)和核糖体结合位点,常常伴随其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和多腺苷酸化信号。“可操作连接的”是指并置,其中如此描述的组分处于允许其以其预期的方式行使功能的关系中。调控序列当其以以下方式连接时与编码序列“可操作连接”,所述方式使得在与该调控序列兼容的条件下获得编码序列的表达。本文所用的术语“转染”是指将外源DNA引入真核细胞。转染可通过本领域已知的各种方法来完成,包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂转染、原生质体融合、反转录病毒侵染以及生物射弹。术语“稳定转染”或“稳定转染的”是指将外源DNA引入且整合进转染细胞的基因组中。术语“稳定转染子”是指已将外源DNA稳定整合进基因组DNA的细胞。术语“瞬时转染”或“瞬时转染的”是指将外源DNA引入细胞,其中外源DNA未能整合进已转染细胞的基因组中。外源DNA在转染细胞的细胞核中存留数天。这段时间里,外源DNA受控于控制染色体中内源基因表达的调控控件。术语“瞬时转染子”是指已摄入外源DNA但未能整合此DNA的细胞。本文所用的术语“抗微生物多肽”通常是指5-100个氨基酸长度的短肽,其表现出抗微生物活性。抗微生物多肽的实例包括但不限于人β-防卫素1、2和3以及组织蛋白酶抑制素。本发明范围内多种抗微生物多肽的序列为已知和可得的,包括在WOxa005/012,492中鉴定的那些,该文献通过引用以其整体结合于本文中。发明详述本发明主要涉及制备、运送和储存通过器官型培养制得的皮肤等同物的体系和方法。特别地,本发明涉及以下方法,其用于干燥或辐照人皮肤等同物以消除所述皮肤等同物的生存力,使得其可在标准条件下长时期储存和运输以用于战场或现场使用,与用于医院相对比。医疗规划为伊拉克自由行动的关键部分且包括烧伤伤亡人员预计数目的预测模型(Barillo,D.J.,等,Trackingxa0thexa0dailyxa0availabilityxa0ofxa0burnxa0bedsxa0forxa0nationalxa0emergencies(追踪全国紧急事件中烧伤床位的每日可用性).Jxa0Burnxa0Carexa0Rehabil,2005.26(2):第174-82页)。这些模型中伤亡人员估计超过了唯一的国防部烧伤中心的容量。国防部协同美国烧伤协会开发了基于现行实践和可用于烧伤护理的技术的大规模人员伤亡计划。第一次海湾战争中已知对方军队使用了包括硫芥子气在内的化学武器。当前的伊拉克和阿富汗冲突中,战场烧伤数量已达到新水平。皮肤的热起疱(发疱)烧伤和化学起疱(发疱)烧伤,以及常用于治疗这些损伤的蚀顶和清创术的程序,导致产生易受细菌病原体感染开放性伤口。不幸的是,过去25年里严重缺乏针对治疗皮肤烧伤或起疱伤口而开发的创新的救生技术。此领域对创新的需求通过2006年10月25-28日由国立综合医学科学研究院赞助的题为“Statexa0ofxa0thexa0Sciencexa0ofxa0Burnxa0Research(烧伤研究科学的状态)”的会议来强调。γ-辐照的人尸体皮肤在环境温度下为稳定的且已成功用于治疗皮肤缺损(Rosales,M.A.,M.Bruntz和D.G.Armstrong,Gamma-irradiatedxa0humanxa0skinxa0allograft:axa0potentialxa0treatmentxa0modalityxa0forxa0lowerxa0extremityxa0ulcers(γ-辐照的人皮肤同种异体移植物:下肢溃疡的潜在治疗药征).Intxa0Woundxa0J,2004.1(3):第201-6页;Cancio,L.C.,等,Burnxa0supportxa0forxa0Operationxa0Iraqixa0Freedomxa0andxa0relatedxa0operations,2003xa0toxa02004(对伊拉克自由行动的烧伤支持及相关手术,2003-2004).Jxa0Burnxa0Carexa0Rehabil,2005.26(2):第151-61页)。然而,未指明这类产品用于有感染迹象的伤口。皮肤伤口(例如起因于起疱性暴露和热损伤的那些)为细菌的生长和源自创面脓毒症的并发症提供了理想的环境。此外,多重耐药临床生物分离群(例如鲍氏不动杆菌(Acinetobacterxa0baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasxa0aeruginosa)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))频率的增加,强调了对于新型方法的需求以补充用于皮肤伤口治疗的当前抗微生物治疗方案(Milner,S.M.和M.R.Ortega,Reducedxa0antimicrobialxa0peptidexa0expressionxa0inxa0humanxa0burnxa0wounds(人烧伤伤口中缩减的抗微生物肽表达).Burns,1999.25(5):第411-3页)。在一些实施方案中,本发明为治疗起疱性皮肤损伤、热皮肤损伤及外伤性皮肤损伤提供现场准备(field-ready)的组织工程干燥或辐照抗微生物皮肤等同物。将所述干燥或辐照皮肤等同物设计用于在环境温度下长期储存,并对具有对外部上皮的起疱性损伤、热伤或外伤损伤的患者有最大的多能性和安全性。在优选的实施方案中,将所述干燥或辐照皮肤等同物改造成将广谱人宿主防卫肽β-防卫素-3(hBD-3)或组织蛋白酶抑制素(hCAP18/LL-37)递送至伤口床。因此,在一些实施方案中,本发明提供包含非活细胞的干燥或辐照人皮肤等同物。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物改造成表达和提供外源抗微生物多肽,优选人β-防卫素-1、2或3或组织蛋白酶抑制素(hCAP18/LL37)。在一些实施方案中,将所述非活的皮肤等同物施用至伤口。在一些实施方案中,将所述非活的人皮肤等同物暂时施用至伤口。在一些实施方案中,将所述非活的人皮肤等同物移除并替换为提供相同抗微生物多肽的其他非活的人皮肤等同物。在其他的实施方案中,将所述非活的人皮肤等同物移除并替换为提供不同抗微生物多肽的其他非活的皮肤等同物。在其他实施方案中,在伤口(例如烧伤伤口)上施用活皮肤等同物或永久皮肤移植物之前将非活的人皮肤等同物移除。在优选的实施方案中,将本发明的皮肤等同物改造成表达外源抗微生物多肽。本发明不限于使用任何具体的抗微生物多肽。在优选的实施方案中,所述抗微生物多肽为人β-防卫素-1、人β-防卫素-2、人β-防卫素-3或者组织蛋白酶抑制素(hCAP-18/LL37)或变体。在一些优选的实施方案中,将编码所述抗微生物多肽的核酸构建体或载体引入角质形成细胞(例如,NIKS细胞)并将转染的角质形成细胞用于通过器官型培养技术制备所述皮肤等同物。在共同待审申请10/909,119中提供制备表达外源多肽以及其它野生型和变体抗微生物多肽的皮肤等同物的优选实施方案,所述申请的全部内容通过引用结合于本文中。A)通过器官型培养制备的皮肤等同物本发明不限于使用能够分化为鳞状上皮细胞的细胞的任何具体来源。实际上,本发明考虑使用各种可分化为鳞状上皮细胞的细胞系和来源,包括原代和无限增殖化角质形成细胞。细胞来源包括从人和尸体供体中切除的角质形成细胞和真皮成纤维细胞(Auger等,Inxa0Vitroxa0Cell(体外细胞).Dev.Biol.-Animalxa036:96-103;美国专利号5,968,546和5,693,332,其各自都通过引用结合于本文中)、新生包皮(Asbill等,Pharm.Researchxa017(9):1092-97(2000);Meana等,Burnsxa024:621-30(1998);美国专利号4,485,096、6,039,760和5,536,656,其各自都通过引用结合于本文中),以及无限增殖化角质形成细胞细胞系例如NM1细胞(Baden,Inxa0Vitroxa0Cell(体外细胞).Dev.Biol.23(3):205-213(1987))、HaCaT细胞(Boucamp等,J.cell.Boil.106:761-771(1988)),以及NIKS细胞(细胞系BC-1-Ep/SL;美国专利号5,989,837,通过引用结合于本文中;ATCCxa0CRL-12191)。这些细胞系中的每一种都可经培养或遗传修饰以产生能够表达或联合表达所需蛋白的细胞系。在特别优选的实施方案中,使用NIKS细胞。一种新型人角质形成细胞系(近二倍体无限增殖化角质形成细胞(near-diploidxa0immortalizedxa0keratinocytes)或NIKS)的发现为使用非病毒载体遗传改造人角质形成细胞提供了机会。NIKS细胞的独特优势在于其为遗传上均匀、无病原体的人角质形成细胞的连贯来源。为此,其可用于应用遗传工程和基因组基因表达方法以提供相对于当前可用技术和皮肤组织产品性能增强的皮肤等同物培养物。由Wisconsin大学鉴别和表征的NIKS角质形成细胞细胞系为非致瘤的,表现出稳定的核型,且在单层培养和器官型培养中均表现出正常生长和分化。NIKS细胞在培养中形成完全分层的皮肤等同物。这些培养物不能被测试的所有标准区别,因而并非形成自原代人角质形成细胞的器官型培养物。然而不同于原代细胞,无限增殖化NIKS细胞将在单层培养中无限地继续增殖。这为在遗传上操纵细胞以及分离具有新有用性质的新克隆提供了机会(Allen-Hoffmann等,J.Invest.Dermatol.,114(3):444-455(2000))。NIKS细胞由分离自一个表观正常男性婴儿的人类新生儿包皮角质形成细胞的BC-1-Ep株系产生。早期传代中,BC-1-Ep细胞表现出无形态学或生长特征,这对于培养的正常人角质形成细胞而言为非典型的。培养的BC-1-Ep细胞表现出成层现象以及程序性细胞死亡的特征。为确定复制寿命,将BC-1-Ep细胞在标准角质形成细胞生长培养基中以3x10⁵个细胞/100-mm皿的密度连续培养至衰老并每隔一周传代(大约1∶25分裂)。至第15代,群体中大部分角质形成细胞出现衰老,这根据出现大量表现出大型、扁平细胞的败育集落来判断。然而,在第16代,表现小细胞尺寸的角质形成细胞为明显的。至第17代,只有所述小尺寸的角质形成细胞存在于培养物中且明显无大的衰老角质形成细胞。幸存于这个推定转捩期的小角质形成细胞产生的群体表现形态学上均匀,并且产生表现出典型的角质形成细胞特征(包括细胞-细胞黏着和表观鳞状物产生)的角质形成细胞集落。幸免于衰老的角质形成细胞以3x10⁵个细胞/100-mm皿的密度连续培养。通常该培养物在7天内达到近于8x10⁶个细胞的细胞密度。此稳定的细胞生长速率一直维持到至少59代,表明该细胞已达到永生。自原始衰老群体出现的角质形成细胞最初命名为BC-1-Ep/自发系而现在称为NIKS。已利用PCR或DNA印迹分析针对原病毒DNA序列筛选NIKS细胞系,所述原病毒DNA序列为HIV-1、HIV-2、EBV、CMV、HTLV-1、HTLV-2、HBV、HCV、B-19细小病毒、HPV-16、SV40、HHV-6、HHV-7、HPV-18和HPV-31的原病毒DNA序列。这些病毒均未检测到。对亲代BC-1-Ep细胞的第3代以及NIKS细胞的第31和54代进行染色体分析。亲代BC-1-Ep细胞具有正常染色体组46,XY。在第31代,所有NIKS细胞包含47条染色体,在8号染色体长臂带有一条额外的等臂染色体。未检测到其他明显的染色体异常或标记染色体。已表明NIKS细胞的核型稳定到至少第54代。NIKS细胞系和BC-1-Ep角质形成细胞的DNA指纹在分析的全部12个基因座方面完全相同,表明NIKS细胞产生于亲代BC-1-Ep群体。NIKS细胞系通过随机机会具有亲代BC-1-Epxa0DNA指纹的几率为4x10^-16。人角质形成细胞三种不同来源(ED-1-Ep、SCC4和SCC13y)的DNA指纹与BC-1-Ep指纹型不同。此数据也显示分离自其他人的角质形成细胞(ED-1-Ep、SCC4和SCC13y)与BC-1-Ep细胞不相关或彼此不相关。该NIKSxa0DNA指纹数据提供了明确的方法来鉴定NIKS细胞系。培养的细胞中,丢失p53功能与增强的增殖潜能和增加的永生频率有关。NIKS细胞中p53的序列与发表的p53序列(GenBank检索号:M14695)相同。人中,p53以两种主要的多态形式存在,通过在72号密码子的氨基酸的子来区别。NIKS细胞中p53的两个等位基因均为野生型且在72号密码子具有序列CGC,其编码精氨酸。p53的另一种常见形式在此位置具有脯氨酸。NIKS细胞中p53的全序列与BC-1-Ep祖细胞相同。亦已发现NIKS细胞中Rb为野生型。无贴壁依赖的生长与体内致瘤性高度关联。为此,研究了含琼脂或甲基纤维素的培养基中NIKS细胞的无贴壁依赖的生长特征。NIKS细胞在含琼脂或甲基纤维素的培养基中4周后仍为单细胞。继续该试验至总共8周以检测缓慢生长的NIKS细胞变体。未观察到任何变体。为确定亲代BC-1-Ep角质形成细胞和无限增殖NIKS角质形成细胞细胞系的致瘤性,将细胞注入无胸腺裸鼠的胁中。人鳞状细胞癌细胞系SCC4,用作这些动物中肿瘤产生的阳性对照。设计样品的注入设计,使得动物在一侧胁接受SCC4细胞而对侧的胁接受亲代BC-1-Ep角质形成细胞或NIKS细胞。这种注入策略消除了肿瘤产生中动物与动物间的差异并且证实该鼠支持致瘤细胞的旺盛生长。亲代BC-1-Ep角质形成细胞(第6代)和NIKS角质形成细胞(第35代)在无胸腺裸鼠中均不产生肿瘤。分析了NIKS细胞在深层培养和器官型培养中经历分化的能力。实施例中详述了器官型培养的技术。在特别优选的实施方案中,本发明的器官型培养的皮肤等同物包括真皮等同物,该真皮等同物形成自胶原或相似的材料以及成纤维细胞。遵照器官型培养方法,将角质形成细胞(例如NIKS细胞或NIKS细胞与来自患者细胞的组合)接种到所述真皮等同物,并形成以鳞状分化为特征的表皮层。对于深层培养的细胞,监控角质化包膜的形成作为鳞状分化的标志。培养的人角质形成细胞中,角质化包膜装配的早期导致形成由内披蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-α和其他蛋白组成的未成熟结构,其代表成熟角质化包膜最内部的三分之一。少于2%的来自贴壁BC-1-Ep细胞或NIKS细胞系的角质形成细胞产生角质化包膜。此发现与先前的研究一致,表明活跃生长的、分会合的角质形成细胞产生少于5%的角质化包膜。为确定NIKS细胞系是否能够在诱导分化时产生角质化包膜,将该细胞从贴壁培养中移出并在用甲基纤维素制成的半固体培养基中悬浮24小时。终末分化的许多方面,包括角蛋白的差异表达和角质化包膜形成,可通过丢失角质形成细胞的细胞-细胞和细胞-基底黏着来体外触发。NIKS角质形成细胞产生与亲代角质形成细胞同样多或通常更多的角质化包膜。这些研究结果表明NIKS角质形成细胞在其启动形成此细胞型特异性分化结构的能力上没有缺陷。为证实NIKS角质形成细胞可经历鳞状分化,将该细胞在器官型培养中培养。生长在塑料基底和浸没于培养基的角质形成细胞培养物复制但表现出有限的分化。具体而言,人角质形成细胞变为汇合的且经历有限的分层而产生由3层或更多层角质细胞层组成的片层。经光学和电子显微镜术,在深层培养和完整的人皮肤中形成的多层片层的构造之间存在显著的差异。与此相反,器官型培养技术允许角质形成细胞在体内样条件下生长和分化。具体而言,该细胞黏附于由包埋在纤维状胶原基质内部的真皮成纤维细胞组成的生理基底。将器官型培养物维持在空气-培养基界面。这样,上片层中的细胞暴露于空气中而增殖中的基底细胞仍然最靠近由通过胶原凝胶的扩散提供的营养物梯度。在这些条件下,形成了正确的组织构造。正常分化表皮的数个特征为明显的。亲代细胞和NIKS细胞系两者中,单层立方基底细胞均静止于表皮和真皮等同物的连接处。圆形的形态和高核质比指示了活跃分裂的角质形成细胞群体。正常人表皮中,基底细胞分裂时产生子细胞,其向上移动进入组织的分化层。子细胞在尺寸上增大且变为扁平和鳞状。最终这些细胞去核且形成角质化的角化结构。这种正常分化过程在亲代细胞和NIKS细胞的上层中均为明显的。上面的表皮层中明显出现扁平鳞状细胞,表明器官型培养物中已发生了分层。器官型培养物最上面的部分中,去核的鳞状物剥离培养物的顶端。到目前为止,未观察到器官型培养中的亲代角质形成细胞和NIKS角质形成细胞细胞系之间在光学显微水平下的分化组织学差异。为观察亲代(第5代)和NIKS(第38代)器官型培养物更详细的特征以及为确认组织学观察结果,使用电子显微镜术分析样品。在器官型培养15天后获取亲代细胞和无限增殖化NIKS人角质形成细胞细胞系,垂直切开基底层以显示分层的程度。亲代细胞和NIKS细胞系均在器官型培养中经历广泛分层并形成正常人表皮的特征性结构。大量的桥粒形成于亲代细胞和NIKS细胞系的器官型培养物中。还观察到,亲代细胞和细胞系的基底角质形成细胞层中均形成了基板和相关的半桥粒。半桥粒为特化的结构,其增加角质形成细胞与基板的黏附且有助于维持组织的完整性和强度。这些结构尤其明显出现在亲代细胞或NIKS细胞直接依附于多孔支持体的区域。这些研究结果与早前的超微结构研究结果一致,该超微结构研究结果使用了在含成纤维细胞的多孔支持体上培养的人包皮角质形成细胞。在光学和电子显微水平下的分析均表明器官型培养中的NIKS细胞系可分层、分化以及形成正常人表皮中存在的结构,如桥粒、基板和半桥粒。B)皮肤等同物的干燥或辐照在优选的实施方案中,将如实施例1中所述制备的皮肤等同物辐照和/或干燥以提供非活的皮肤等同物。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物干燥以消除细胞生存力。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物辐照,例如,γ辐照。在一些实施方案中,对所述皮肤等同物给以剂量为约0.5kGy-约25kGy的γ辐照。在一些实施方案中,对所述皮肤等同物给以剂量为约0.5-约12kGy的辐照,更优选约1kGy-约5kGy的γ辐照。任何情况下,递送到所述皮肤等同物的辐照量优选足以造成所述皮肤等同物所含细胞成为非活的,该细胞的非活通过MTT生存力测定法或其他适宜的生存力测定法来测定。在另外优选的实施方案中,将所述皮肤等同物真空干燥或冷冻干燥。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物在辐照之前干燥。在一些优选的实施方案中,将所述皮肤等同物在干燥或辐照前包装在无菌包装中。在另外优选的实施方案中,将所述皮肤等同物用诸如纱布等无菌织物包装以允许储存、运输和终端用户的简易使用。在其他实施方案中,所述干燥或辐照皮肤等同物保持了在与伤口接触后释放内源多肽至伤口表面的能力。在另外实施方案中,所述干燥或辐照皮肤等同物保持了在与伤口环境接触后释放外源多肽至伤口的能力。在另外实施方案中,将所述皮肤等同物在使用前冷藏,而在其他实施方案中,将所述皮肤等同物在使用前储存于环境温度下。应认识的是,所述皮肤等同物干燥的程度可通过比较干燥皮肤等同物的质量和未干燥皮肤等同物(湿皮肤等同物,即,刚从器官型培养中移出的皮肤等同物)的质量来确定。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物干燥至最终质量小于湿皮肤等同物质量的75%、50%、25%或优选15%。在一些实施方案中,本发明的干燥皮肤等同物具有的质量小于湿的或未干燥皮肤等同物质量的75%、50%、25%或优选15%。在一些实施方案中,将所述干燥皮肤等同物在施用于受试者之前再水化。在一些实施方案中,所述再水化皮肤等同物具有的抗张强度为0.1-5.0MPa,优选约0.4-约1.8MPa。在一些实施方案中,所述再水化皮肤等同物具有的初始DPM值为约20DPM-约300DPM,优选约70-约140DPM,以及DPM变化值为约5DPM-约400DPM,优选约10DPM-约220DPM。在一些实施方案中,将所述干燥和/或辐照皮肤等同物用于递送目的肽或蛋白至受试者,以及在一些优选实施方案中至受试者的伤口床。表达外源肽和蛋白的皮肤等同物先前已由发明者描述,参见,例如WOxa005/012492,通过引用以其整体结合于本文中。在一些实施方案中,将所述皮肤等同物改造成表达一种或多种抗微生物多肽。在一些实施方案中,所述抗微生物多肽为组织蛋白酶抑制素、人β-防卫素1、人β-防卫素2、或人β-防卫素3、或其组合。在优选的实施方案中,所述肽或多肽为外源的,即,由改造进入角质形成细胞的外源基因构建体编码和表达的,该角质形成细胞用来制备所述皮肤等同物。由所述皮肤等同物递送的肽或多肽的量可通过将水溶液施用至皮肤等同物并测定递送进所述溶液的肽或多肽的量来确定。在一些实施方案中,提供所述多肽的量为1-1000ng抗微生物多肽/毫升提取液。在一些实施方案中,提供所述多肽的量为10-500ng抗微生物多肽/毫升提取液。C)治疗应用已设想本发明的非活皮肤等同物可在治疗上使用。在一些实施方案中,将所述干燥或辐照皮肤用于伤口闭合和烧伤治疗应用。使用自体移植物和同种异体移植物治疗烧伤和伤口闭合已描述于Myers等,A.J.Surg.170(1):75-83(1995)以及美国专利号5,693,332、5,658,331和6,039,760,其各自都通过引用结合于本文中。在一些实施方案中,所述皮肤等同物可与真皮替代物(例如DERMAGRAFT或INTEGRA)结合使用。因此,本发明提供伤口(包括由烧伤造成的伤口)闭合的方法,包括提供皮肤等同物和受伤的患者,以及在使得伤口闭合的条件下用所述皮肤等同物治疗所述患者。在一些实施方案中,利用所述皮肤等同物治疗慢性皮肤伤口。慢性皮肤伤口(例如,静脉曲张性溃疡、糖尿病性溃疡、压迫性溃疡)为严重的问题。治愈这种伤口常常花费远超过一年的治疗。目前治疗选择包括敷料和清创术(使用化学药品或外科手术清除坏死组织),和/或在感染的情况下抗生素。这些治疗选择需要长久的时间和大量的患者依从性。因此,可增加医师在治愈慢性伤口方面的成功且加快伤口愈合速率的疗法将满足本领域未满足的需求。因此,本发明设想用皮肤等同物治疗皮肤伤口,该皮肤等同物包含本发明的细胞(例如,NIKS细胞)。在一些实施方案中,将皮肤等同物局部施用于伤口。在其他实施方案中,将包含NIKS细胞的皮肤等同物用于部分皮层伤口(partialxa0thicknessxa0wound)上的移植。在其他实施方案中,将包含NIKS细胞的皮肤等同物用于全层伤口(fullxa0thicknessxa0wound)上的移植。在其他实施方案中,将包含NIKS细胞的皮肤等同物用于治疗多种类型的内部伤口,包括但不限于排列在胃肠道的粘膜内部伤口、溃疡性结肠炎,以及可能由癌症治疗引起的粘膜炎症。在又另外的实施方案中,将包含表达宿主防卫肽的NIKS细胞的皮肤等同物用作暂时或永久性的伤口敷料。在再另外的实施方案中,将所述细胞改造成提供附加的治疗剂给受试者。本发明不限于递送任何具体的治疗剂。实际上,设想的是可将各种治疗剂递送给受试者,包括但不限于酶、肽、肽类激素、其他蛋白、核糖体RNA、核酶、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)以及反义RNA。在优选的实施方案中,所述治疗剂为宿主防卫肽,如人β-防卫素1、2或3或组织蛋白酶抑制素,参见,例如,美国专利申请10/909,119,通过引用以其整体结合于本文中。这些治疗剂可为各种目的而递送,包括但不限于修正遗传缺陷的目的。在一些具体的优选实施方案中,所述治疗剂以解毒有遗传的先天性代谢缺陷(例如,氨基酸代谢病(aminoacidopathesis))的患者为目的而递送,其中移植物充当野生型组织。设想的是递送所述治疗剂修正所述缺陷。在一些实施方案中,用编码治疗剂(例如,胰岛素、凝血因子IX、红细胞生成素,等等)的DNA构建体转染所述细胞,然后将转染细胞给予受试者。所述治疗剂随后从移植物中递送至患者的血流或其他组织。在优选的实施方案中,编码所述治疗剂的核酸可操作地连接适当的启动子。本发明不限于使用任何具体的启动子。实际上,设想使用各种启动子,包括但不限于诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子以及角质形成细胞特异性启动子。在一些实施方案中,将编码所述治疗剂的核酸直接引入角质形成细胞中(即,通过电穿孔、磷酸钙共沉淀或脂质体转染)。在其他优选的实施方案中,提供编码所述治疗剂的核酸作为载体且通过本领域已知的方法将所述载体引入角质形成细胞中。在一些实施方案中,所述载体为诸如复制型质粒等附加型载体。在其他实施方案中,所述载体整合进角质形成细胞的基因组中。整合型载体的实例包括但不限于反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、非复制型质粒载体和转座子载体。实验性实施例提供下列实施例以表明和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面且不应理解为限制其范围。在以下实验性公开内容中,下列缩写适用:eq(当量);M(摩尔的);mM(毫摩尔的);μM(微摩尔的);N(正常的);mol(摩尔);mmol(毫摩尔);μmol(微摩尔);nmol(纳摩尔);g(克);mg(毫克);μg(微克);ng(纳克);l或L(升);ml或mL(毫升);μl或μL(微升);cm(厘米);mm(毫米);μm(微米);nm(毫微米);C(摄氏度);U(单位),mU(毫单位);min.(分钟);sec.(秒);%(百分比);kb(千碱基);bp(碱基对);PCR(聚合酶链反应);BSA(牛血清白蛋白);CFU(集落生成单位);kGy(千戈瑞);PVDF(聚偏二氟乙烯);BCA(二辛可宁酸);SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。实施例1本实施例描述制备皮肤等同物的方法。培养基.器官型培养过程使用三种不同的培养基,均基于美国专利7,407,805中所述SMB培养基的配方,例外的是从所有培养基中除去霍乱毒素。FM01用来增殖在皮肤等同物真皮等同物层中使用的正常人真皮成纤维细胞(NHDF)。除了含有胎儿克隆II血清(2%最终)和缺少霍乱毒素之外,FM01具有与SMB相同的配方。KM01用来生长NIKS角质形成细胞,且除了含有2.5%胎儿克隆II并额外加入了终浓度为5ng/ml的表皮生长因子(EGF)之外,其具有与SMB相同的组成。SM01用于皮肤等同物制备的表皮分层阶段期间且除了不含霍乱毒素之外,与SMB相同。真皮等同物制备.第0天,将冷冻的NHDF细胞解冻和涂板。次日(第1天)用FM01饲养所述细胞以移除残留的冷冻保护剂且在第3天重复。第4天,将其收获以用于真皮等同物中。为制备真皮等同物,首先将I型鼠尾胶原在0.03N醋酸中稀释至3mg/ml,并在冰上冷却。将浓缩Ham’sxa0F12培养基的混合物(8.7X标准强度且用pHxa07.5的HEPES缓冲)与胎儿克隆II混合。这两种溶液的终溶液体积为11.3和9.6%。向培养基混合物中加入1Nxa0NaOH(终溶液的2.4%)。然后向混合物中加入(74.7%)稀释的胶原。向混合物中加入2%体积的悬浮成纤维细胞(2.78x10⁶/ml)。将9ml最终的真皮等同物混合物倒入各个75mmxa0TRANSWELL内眼板(Corningxa0Costar)中。50-70分钟凝胶形成期之后,将Transwell内眼板转移到150mm培养皿中的不锈钢网表面。将80mlxa0FM01置入TRANSWELL内眼板外面的150mm皿中以及10ml置于真皮等同物之上。在用于器官型培养物之前,将真皮等同物置入37°C、5%CO₂、90%相对湿度的培养箱中4-5天。NIKS生长和接种.将NIKS细胞解冻且以约5x10⁵个细胞/100mm皿的密度涂板。NIKS培养可在存在或缺乏鼠饲养细胞时进行。第1天,用新鲜KM01饲养所述NIKS细胞以移除残留的冷冻保护剂。第3天再次饲养所述NIKS细胞。第4天,从初始的p100培养物中收获所述NIKS细胞且以1.2x10⁶/瓶的密度接种入225cm²培养瓶中。第7和8天用新鲜培养基饲养所述NIKS培养物。第9天,将所述NIKS细胞收获、计数并重悬于SM01中。将2.27x10⁴个NIKS细胞/cm²接种到真皮等同物表面。皿中为饲养和升至空气-培养基界面的培养物。将培养物转移至设为75%的受控湿度培养箱,在此其继续剩余的生长。第14、18、22、25、28和30天用SM01饲养培养物。实施例2对制备非活的无菌皮肤等同物组织所需γ辐照的致死剂量的确定开发辐照皮肤等同物的制备方案以先前对工程人皮肤组织产品建立的28天制备过程为基础。将已分别针对增强表达宿主防卫肽hBD-3和hCAP18/LL-3改造的9F1和2D2组织,采用无菌程序来制备。将组织转移到营养凝胶室,并在包装和运输之前密封。γ辐照由Sterigenics,Inc.在其Charlotte,Northxa0Carolina设施中使用ExCell高精密度γ辐照器来进行。组织接受了五种辐照剂量中的一种:0kGy、1kGy、5kGy、8kGy或11kGy。这些剂量是基于先前对同种异体移植物组织上的相似剂量进行的评价而选定的。辐照后,在下文指示的时间分析之前将组织冷藏。已处理的样品返回Stratatech时,发现一些储存在营养凝胶上的组织脱离了其下面的支撑膜,导致组织的折叠和起皱。在辐照和未辐照组织中均观察到此现象。随后开发解决此问题的运送程序。参见下文实施例。无菌检验:从9F1和2D2组织中获取打孔活检,该组织经受了剂量范围0-11kGy的γ辐照。将来自辐照后储存3天的组织的样品接种至胰胨豆胨培养液或液体巯基乙酸盐培养基。将培养物在美国药典对无菌检验定义的条件下孵育14天。14天后,目测检查培养物的微生物生长。未观察到任何分析的组织有微生物生长,表明所述组织在处理、辐照和运输全程中保持无菌。通过MTT生存力测定法检验生存力:辐照处理后3天、7天或14天从对照或γ辐照9F1和2D2组织中获取活检,并通过MTT生存力测定法测定细胞生存力。简而言之,MTT底物3-(4,5-二甲基噻唑基-2-基)-2,5-二苯基四唑ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="68"/>溴化物,通过活细胞中细胞脱氢酶转化为MTT甲ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="63"/>产物。然后将有色产物萃取入异丙醇,在550nm处读数。在四个独立的组织分批中测定生存力,代表性的结果显示于图1中。未辐照组织的生存力在储存期间未显著改变。用1kGy辐照处理的组织在辐照后3天具有残留的酶活性,该残留酶活性在辐照后7和14天继续降低。然而,用5、8或11kGy剂量处理的组织在所有时间点显示出最小的残留酶活性,且在14天储存期的全过程中保持低酶活性。至辐照后14天,用1kGy辐照的组织的代谢活性降低到与较高辐照剂量所示同样低的水平。通过角质形成细胞迁移测定法确定生存力:从对照组织或辐照组织中建立活检外植块培养物以确定角质形成细胞是否已通过辐照处理而失活。将从辐照后3天的组织中获取的打孔活检转移至生长培养基,培养48小时,并用苏木精/伊红和数字显微镜进行组织学染色。获取图像以评定组织构造,以及根据角质形成细胞从由图2中示意图的活检穿孔创建的伤口边缘迁移出而记为阳性或阴性。细胞迁移在未辐照9F1和2D2组织中为明显的,但不存在于所有经受γ辐照的组织中。成纤维细胞生长晕测定:辐照后7天从对照和辐照组织中获取活检,且用细菌胶原酶处理以释放成纤维细胞。将释放自这些组织的细胞转移至培养皿,使其在培养基中生长六天,并通过亚甲蓝染色来显现。分别基于存在或不存在染色的蓝色细胞,将成纤维细胞细胞生长晕记为阳性或阴性。分离自未辐照或辐照组织的成纤维细胞培养物的图像显示于图3中。未接受辐照的对照组织中观察到了细胞生长晕,但其不存在于来自辐照组织的标本中。上述研究确定了制备和处理组织全程中保持了产品无菌。用1kGy的辐照剂量处理皮肤等同物组织产生了使用两个独立的生存力测定为非活的组织。5kGy或更高的剂量产生了通过全部三种方法评定为非活的组织。实施例3γ辐照皮肤等同物组织的结构性质的评价冷藏3天后辐照组织的结构性质通过用苏木精和伊红组织学染色并通过光学显微镜术观察来评价。组织学染色证实了辐照组织保留正常组织构成和总体形态。所有细胞层,包括真皮层、基底层和棘状角质形成细胞层,以及角质层,在未辐照对照和辐照组织中为可识别的,但在较高的辐照剂量下有一些明显的组织损伤,显现为真皮和表皮区室之间的裂隙。因此,确定1kGy和5kGy剂量水平作为最有前景的水平,用于后续研究。实施例4γ辐照皮肤等同物组织的生化性质(包括体外抗微生物活性)评价.γ辐照直接和非直接地激发对蛋白的剂量依赖性损伤。直接损伤由电离引发,而非直接损伤涉及水分子的水解和大分子的氧化修饰或交联。因此,组织蛋白在辐照时可表现出增强的降解和降低的溶解度。由于预期开发中的产品通过提供高水平的宿主防卫肽来起作用,所以有必要确定辐照后的蛋白可及性和生物活性。辐照组织的分析包括可溶性蛋白和总蛋白分析、免疫印迹分析以及抗微生物活性测定。可溶性蛋白和总蛋白分析:从未辐照和辐照2D2和9F1皮肤组织中获取打孔活检并将其浸入0.2mL无菌水中。将活检样品在37°C孵育72小时以提取蛋白,收集上清液,并通过BCA测定法定量总蛋白。如图4所示,洗提入上清液中的总蛋白随辐照剂量的增大而减少。这些结果与蛋白经由交联(降低蛋白溶解度的修饰)的广泛报道辐照介导损伤一致。然而,初步研究中使用的组织包装在由不粘连纱布组成的较小水合的环境中,消除了这种辐照剂量依赖的蛋白可提取性的降低(参见实施例6)。肽分析:蛋白可提取性可反映经处理组织的总体生化状态;支持开发抗微生物伤口敷料更相关的参数为抗微生物肽的完整性和溶解度。为评价这些参数,对提取自辐照和未辐照2D2组织的蛋白进行免疫印迹分析。从2D2组织中获取打孔活检,并转移至无血清生长培养基中另外48小时。收集来自双份组织的条件培养基,通过SDS-PAGE将蛋白分开,转移至PVDF膜,并针对免疫印迹分析而使用标准方法处理。使用hCAP18-特异性抗体来检测抗微生物肽,该抗体检测完整的人抗微生物蛋白hCAP18及其生物活性蛋白水解片段LL-37。在根据组织调节的培养基中易检测到完整的hCAP18和LL-37两者,不依赖于辐照剂量,且这些蛋白在SDS-PAGE上的迁移模式也不受用于这些研究中的辐照剂量影响。从未辐照对照组织中释放的肽有轻微的增加。这些轻微的增加可能起因于活组织新合成并分泌肽,或者是这些组织中肽溶解度增大的结果。尽管有此观察结果,组织蛋白酶抑制素抗微生物肽保持完整且可容易地从辐照组织中提取。抗微生物活性测定:确认了从未辐照和辐照组织中释放的抗微生物肽的完整性之后,我们评价了对照和辐照组织的抗微生物性质。简而言之,从辐照或未辐照组织中获取打孔活检,并将其转移至无血清培养基培养2、4或24小时以允许提取抗微生物肽。收集培养基并与接种物组合,该接种物为含1.0x10³CFU肉葡萄球菌(S.carnosus)的细菌生长培养基。将此混合物在37°C以恒定振荡孵育60min。然后,使用WASP2螺旋接种仪(Microbiologyxa0International,Frederick,MD)将样品涂布至细菌学平板并在37°C孵育16小时。计菌落数,并确定活细菌密度(以CFU/mL表示)。将值归一化于在不含组织提取物的无血清培养基存在下生长的细菌培养物密度。如图5所示,从用1kGy辐照处理的2D2组织中提取的样品表现出增强的抗微生物活性,这通过细菌密度在2和4小时条件作用期时相对于未辐照组织减小来指示。未在用5kGy剂量处理的组织中观察到这种抗微生物活性的短暂增强,其在更长的组织条件作用时间下亦不明显。1kGy辐照的9F1组织中观察到相似的活性增强(数据未显示)。此改进的抗微生物活性令人惊奇,因为已知辐照组织可在较长时期内释放较低量的总蛋白和组织蛋白酶抑制素抗微生物肽。然而,当上述研究使用孵育了至少48小时的组织时,只在提取自2或4小时的辐照组织的样品中观察到改进的抗微生物活性。总而言之,辐照皮肤等同物的生化分析显示了可溶性蛋白的整体水平降低,但是抗微生物肽完整性大都得到了保持。显示从1kGy辐照的皮肤等同物组织中提取的肽,相对于对照细菌培养物将细菌生长减少高达80%。这些结果表明了维持这些极限处理的工程皮肤组织生物活性的可行性。实施例5辐照皮肤等同物组织的储存对储存于营养凝胶的辐照9F1和2D2组织的短期储存能力进行了分析。这些研究中,分析了处理后7天和37天的冷藏辐照组织,且评定或测定了组织构造和抗微生物肽活性。37天的冷藏储存期间保持了辐照组织的整体组织构成。检测的剂量水平下,冷藏组织维持了真皮和表皮区室两者。表皮区室内,基底层和棘状角质形成细胞层仍有区别,而角质层大都仍然不变。组织内最小的细胞损伤表现为在基底层和基底上层的角质形成细胞之间的细胞间隙,且组织的储存导致真皮和表皮区室之间的局部分离。然而,这在所有检测时期的组织中都观察到了。抗微生物肽活性:从辐照之后在冷藏温度下储存了7天或37天的辐照或未辐照9F1和2D2组织中获取样品。如上文进行抗微生物活性测定。确定了细菌密度(CFU/mL)且将数据归一化于在存在新鲜无血清生长培养基下生长的细菌培养物。9F1和2D2组织的这些研究结果分别显示于图6和7中。用1kGy辐照辐照且冷藏储存7天的9F1组织,显示细菌生长相对于对照细菌培养物减少86%。相比之下,未辐照9F1组织导致细菌生长减少52%。同样地,与未辐照2D2组织引起57%的减少相比,冷藏7天的1kGy辐照2D2组织导致了细菌生长减少72%。1kGy辐照9F1和2D2组织的抗微生物活性经过37天的冷藏储存恢复到近于未辐照组织的抗微生物活性,但相对于对照培养物依然表现出抗微生物活性。尽管所有以5kGy处理的组织在辐照后储存7天时保留了可测量的抗微生物活性,但是此活性在长期储存中降低。这些数据表明辐照组织可在多于一个月的冷藏储存之后提供可检测的抗微生物活性。实施例6包装构型的影响观察到上文实施例2中处理的组织,与下面的支撑膜分离,导致组织的折叠和起皱。为避免此现象,开发了一种包装构型以防止组织移动。此改良的构型中,将组织从其内眼板中移出,转移至无菌的不粘连纱布上,并密封入无菌塑料袋中。从所述塑料袋中移出后,组织未显示明显的起皱或折叠。别处已描述了γ辐照对蛋白的作用,且这些作用大部分通过样品内水分子水解产生的自由基和活性氧类别来介导。由于用于运输工程组织产品的营养凝胶室的高水分含量,因此预料包装在营养凝胶室或干的不粘连纱布上的辐照组织在辐照处理期间会表现出不同的生化性质。从未辐照和辐照2D2和9F1组织中获取打孔活检,将其浸没于0.2mL无菌水。将活检在37°C孵育24小时,收集上清液,并通过BCA测定法定量洗提的蛋白。如图8所示,在包装在营养凝胶室上的组织中,总水溶性蛋白随辐照剂量的增大而减少,与上文所述研究一致。相比之下,将辐照组织包装在不粘连纱布上使蛋白可及性恢复至近于对照水平的蛋白可及性。因此,辐照前将组织包装在纱布上可通过提供更不允许蛋白交联的环境来降低辐照组织中蛋白损伤的水平。实施例7工程皮肤等同物的冷冻干燥如实施例1所述制备工程皮肤等同物。完成时,将包含皮肤等同物的TRANSWELL内眼板无菌转移入塑料TRANSWELL皿中,加盖,并置于维持在20°C的VIRTISxa0Genesis冷冻干燥机(Gardiner,NY)的层架上。如下来冷冻组织:通过在2100mT压力下以-1.33°C/分钟的速率将温度从20°C降至-20°C,以及在2100mT压力下以-0.67°C/分钟的速率从-20°C降至-60°C。应用真空以降低压力至0mT,且以+0.25°C/分钟将组织从-60°C加热至20°C。通过将样品保持在0mTxa020°C至少16小时来完成干燥。实施例8工程皮肤等同物的真空干燥如实施例1所述制备工程皮肤等同物。将包含皮肤等同物的TRANSWELL内眼板无菌转移入塑料TRANSWELL皿中,加盖,并置于维持在25°C的VIRTISxa0Genesis冷冻干燥机小室的层架上。以八分钟的间隔将小室压力降至下列压力:900mT、830mT、760mT、690mT、620mT、550mT、490mT、430mT、370mT、310mT、250mT、200mT、150mT、100mT、50mT、25mT。将样品保持在25mT至少16小时以完成干燥。实施例9工程皮肤等同物的干质量制备工程皮肤等同物并在冷冻干燥之前和之后获得湿组织质量。冷冻干燥之后获得的组织质量范围为原始湿组织质量的11.7%-13.7%。(表1)。表1.工程皮肤组织的干质量测定 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实施例10干燥工程皮肤等同物的辐照如实施例1所述制备针对过表达宿主防卫肽hCAP18/LL-37而改造的皮肤等同物组织,并且如实施例7和8所述进行干燥。干燥后,将组织从TRANSWELL内眼板中移出并热密封入无菌塑料袋中。如实施例2所述在Sterigenics以1、5或25kGy的剂量水平辐照干燥组织,随后将组织在室温下储存长达两个月。整体组织构造通过用苏木精和伊红染色组织切片来评定。组织生存力通过如实施例2所述的MTT测定法来评定。在干燥的经辐照组织中使用阻抗计测量法评定组织屏障功能。将获取自干燥的经辐照组织的试样在单向拉伸下拉断并确定机械性能。抗微生物肽水平通过获取自干燥的经辐照组织的可溶性提取物的ELISA来定量。组织学分析:从新鲜组织或从以下组织中获取活检,所述组织已在环境温度下冷冻干燥或真空干燥,随后以三种剂量水平中的一种辐照并在环境温度下储存长达两个月。使用苏木精/伊红针对组织学染色处理试样,以显现组织构造,然后在400x放大率下获取数字显微照片。经辐照的冷冻干燥和真空干燥组织的典型图像分别显示于图9和图10中。新鲜制备的试样表现对工程皮肤替代物组织的预期组织构造(图9和10,画面1)。经受辐照的冷冻干燥皮肤等同物组织维持正常的总体组织构造,具有可识别的真皮和表皮组分(图9)。真皮区室表现出结构变化,包括压实和与表皮区室的部分分层。表皮区室内,基底层、棘层和角质层的组构大都得到了保持。真空干燥的经辐照工程皮肤等同物保留正常的总体组织结构(图10);包括可识别的真皮层、基底层和棘状角质形成细胞层,以及角质层。然而,两个真皮区室均明显压实,形成了比未保存组织更薄的组织。辐照剂量的增加未引起真空干燥组织在总体组织结构上进一步的变化。通过MTT生存力测定法检测生存力:从新鲜组织或者从以下组织中获得打孔活检(8mm直径),所述组织已在环境温度下冷冻干燥或真空干燥并以三种剂量中的一种辐照。处理活检,通过使用TECANGENios平板读数器(TECANxa0US,Durham,NC)测定550nm处样品的吸光度来定量代谢活性。将代谢活性归一化于新鲜制备的对照组织。如图11所示,联合使用干燥和辐照使代谢活性降低高达90%,与先前观察到的在辐照组织中观察到的代谢活性方面的降低一致(实施例2)。组织屏障功能分析:在从工程皮肤组织中切下的ASTM狗骨形试样上进行屏障功能,该工程皮肤组织已真空或冷冻干燥且已暴露于三种辐照剂量(1、5或25kGy)中一种。从干燥后的组织中钻取试样并在储存或辐照之前独立包装。将狗骨形试样从其包装中移出、再水化,并检测屏障功能。简而言之,将试样表皮侧朝上置于TRANSWELL内眼板上,向皿中置入10mL培养基,并使其在室温下再水化(从下到上)1小时。将TRANSWELL内眼板转移至润湿的滤纸且使其平衡45min。各试样柄区(gripxa0region)的表皮屏障功能通过使用NOVAxa0Dermaphase测量仪(NOVAxa0Technologyxa0Corp,Portsmouth,NH)测定组织表面的表面电容来定量,所述测量仪在临床上用于评定表皮屏障功能。10秒测量期内阻抗测量值的变化反映了组织表面水合状态的变化。因为增加的水合起因于穿过角质层的水通路,所以所述变化的大小反映了表皮透性障的完整性。基于收集自多于80组StrataGraftntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="49"/>组织的屏障功能数据,认为<294DPM的初始读数和小于658DPM单位的变化为可接受的屏障功能。如图12所示,组织表面电阻抗的变化和初始DPM读数对于干燥辐照组织和新鲜制备工程皮肤组织而言为相似的。新鲜制备和干燥辐照组织均达到了据历史数据认为可接受的表皮屏障功能,该历史数据针对StrataGraftntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="46"/>皮肤组织而整理。基于这些结果,预期干燥工程皮肤组织的辐照不会造成对所得产物的屏障功能的不利影响。 抗张强度分析-表皮屏障检测之后,将各试样浸没于10mlxa0PBS且使其再水化至少另外1小时。再水化之后,使用Mitutoyo测厚规在计量区测量试样厚度。然后在PBS再循环维持试样水合的情况下,将拉伸试样以100%/min(25mm/min)的速率以单向拉伸拉断。将各试验的负载和位移数据输出至Microsoftxa0Excel,用于分析和数据整理。这些分析的数据显示于图13中。工程皮肤等同物的干燥和辐照导致对组织的机械性能产生可变的影响。组织试样之间的高可变性使机械检测结果的分析复杂化,然而观察到了数个强烈的趋势。干燥组织,不论干燥方法或辐照剂量,再水化之后不能完全恢复其干燥前的厚度,形成了与新鲜对照相比明显更薄的组织试样。根据组织学,这种缩小似乎主要发生在真皮层,表皮的厚度维持相对恒定。干燥还有一个强烈的趋势:形成更硬和更脆的组织,辐照增强此作用。这可通过增加的起始模量以及拉断时伸长率减少来看出。尽管一些模量值的增加可归因于厚度的减小(对于既定负载的增加而增大测量应力),但是厚度差异未充分解释组间差异。结果的可变程度使得难以辨别具有统计可靠性的附加效应。平均抗张强度似乎未受干燥或高达25kGy辐照的不利影响;然而,辐照可引起轻微但统计学上不显著的最大负载的降低。抗微生物肽分析:使用市售ELISA检测试剂盒定量来自工程皮肤等同物的hCAP18衍生肽。通过将无血清培养基局部涂敷至新鲜或保藏组织的表面(0.16ml无血清培养基/cm²),且在37°C平衡组织2小时来制备可溶性提取物。将提取物用于ELISA,其检测完整的hCAP18蛋白和转录后加工的LL37代谢物。样品相对于重组LL37肽的标准曲线来定量,将hCAP18蛋白水平表示为ng蛋白/ml组织提取物。如表2所示,冷冻干燥和真空干燥的组织表现出的可提取hCAP18衍生肽水平,大于75%的获取自新鲜制备工程皮肤组织的可提取hCAP18衍生肽水平。表2.干燥的经辐照工程皮肤等同物中hCAP18衍生肽的定量。将值表示为来自两个独立组织的组织提取物中免疫反应性蛋白的平均浓度±标准偏差。 xa0xa0试验组
xa0xa0hCAP18蛋白(ng/ml)
xa0xa0EG111008新鲜
xa0xa097.4±14
xa0xa0EG111008冷冻干燥0kGy
xa0xa073.1±4.8
xa0xa0EG111008冷冻干燥1kGy
xa0xa0183±4.8
xa0xa0EG111008冷冻干燥5kGy
xa0xa0179±2.0
xa0xa0EG111008冷冻干燥25kGy
xa0xa0120±3.2
xa0xa0EG111008真空干燥0kGy
xa0xa0122±10
xa0xa0EG111008真空干燥1kGy
xa0xa0120±15
xa0xa0EG111008真空干燥5kGy
xa0xa077.7±3.4
xa0xa0EG111008真空干燥25kGy
xa0xa066.8±7.0
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